為什么CAR-T細胞抗白細胞的活性可以維持10年？
2010年，以CD19為靶點的CAR-T細胞療法（CTL019）啟動了一期臨床試驗，并首次用于治療CLL。前兩名患者經過十多年疾病持續完全緩解，并且可以持續檢測到CAR-T細胞。
患者1的CTL019擴增在第3天達到峰值，患者2在第31天達到峰值。這種延遲可能是由于患者2細胞劑量低了78倍。然而，這種差異的影響并不顯著，兩名患者10年多時間里都保持完全緩解。
在最新的血液檢測中（1號患者10年后，2號患者9年后），仍能在兩名患者中檢測到CTL019細胞，分別占總T細胞的0.8%和0.1%。
流式細胞術顯示，在CTL019輸注三年后，CD19+B淋巴細胞和CLL細胞要么檢測不到，要么被抑制到非常低的水平（不到細胞的1%）。
圖1：1號患者（頂部）和2號患者（底部）。紅色三角形表示CAR-T細胞，藍色圓點表示抗CAR抗體的流式細胞術染色，藍色方形表示細胞治療后的B細胞數量?？偟膩碚f，CLL和B細胞已經連續被抑制了十年，數量很少；CAR-T細胞一直存在。
那么，到底是什么樣的CAR-T細胞在患者體內停留了10年？
為了了解這些CAR-T細胞的克隆特征，研究人員以分類后的CAR-T細胞為研究對象，并使用深度測序來檢測TCR b鏈庫（TCR-seq）以及CAR-T細胞中的慢病毒載體整合位點（LVIS）。
在1號患者（0-9年）和2號患者（0-7.2年）的CAR-T細胞基因組中，研究人員分別發現7930和3406個獨特的CAR載體整合位點；在最初制備的CAR-T細胞中，分別有3378個和1216個整合位點作為基線。無論是最初的CAR-T還是以后的時間點，大多數插入都被整合到基因中，并且整合到內含子中的概率高于其他部位。
LVIS數據顯示，1號患者的CAR-T克隆組成在前1.6年并不穩定；1.9年后變得相對穩定。2號患者的CAR-T克隆組成在第31天到第1年以及1年到5年期間相對穩定。
在1號患者9.4個月至1.9年的階段，出現了FOXP1、ZNF44、RHODMTOR、BCAP31、ZNF598和NPRL3等基因整合的CAR載體克隆。LSM4和CSNK2A基因整合位點在8.2-9.0年出現。
2號患者出現了SRCAP、PATL1和KCTD3整合位點克隆，這些克隆在前兩年最為顯著；ZZEF1持續超過7年。
這些數據表明，兩者的基因整合點并不重疊。
圖2. 患者1（左）和2（右）的不同整合部位隨時間變化（至少有一個時間點>10%）。
接下來，每個人都想知道，在患者的不同時間點，這種有效的CAR-T細胞的表型是什么？它們各自的特點是什么？
為了回答這個問題，研究人員使用質量細胞儀（CyTOF）檢測了40種抗體在不同時間點的CAR-T細胞表型。實驗選擇CD3+CAR+T細胞進行分析，每個時間點至少包括100個代表性細胞。
首先觀察患者1，在再融合1.8個月時，CD8+細胞占所有CAR-T細胞的29.3%，并在隨后的一段時間內逐漸減少。到1.4年，CD4+占CAR-T細胞的97.5%；在3.4年到9.3年之間，CD4+達到了99.6%。
雖然2號患者的CAR-T細胞擴張有一定的延遲，但也顯示出類似的趨勢：CD8+在開始時占很大比例，隨著時間的推移，CD4+出現的較晚，7.2年后占CAR-T成分的97.6%。。
此外，在2號患者中也檢測到大量CD4–CD8–雙陰性CAR-T細胞，在2.5個月和1.6年時分別占所有CAR-T細胞的33.4%和46.5%，并隨著時間的推移逐漸減少。
這些CD4–CD8–CAR-T細胞有一種特殊的表型：盡管雙陰性，但它們表達細胞毒性標記物，如GZMB、2B4、CD57、CD85j、T-bet、PD-1和Helios。其中，Helios的表達是區分CD8+T細胞的標志，因此這組細胞被稱為CD4-CD8-HelioshiCAR-T細胞。
圖3.CyTOF分析顯示，在不同時間點的兩名患者樣本中，CD3+CAR+T細胞共包含五個主要細胞亞群：CD4+、CD4+Ki67hi、CD8+GZMK、CD8+GZMB和CD4-CD8-Helios+hiCAR-T細胞。
CD4+ CAR-T細胞高表達Ki67，表明它們處于增殖狀態。Ki67hi CD4+ CAR-T細胞作為兩名患者的主流細胞群一直保持穩定：1號患者1.8個月時該細胞群占所有CAR-T細胞的15.9%，9.3年增加到97%。
CD8+CAR-T細胞也表現出類似的增殖趨勢，但Ki67的表達相對低于CD4+ CAR-T細胞。這些Ki67hi CD4+ CAR-T細胞具有特異性表達特征，包括激活標記物CD38、HLA-DR和CD95、轉錄因子EOMES和TOX、免疫檢查點標記物CTLA-4、LAG-3和TIGIT，以及記憶細胞標記物CD27和CCR7。
圖4. 在五個CAR-T細胞亞群中，CyTOF檢測到各組的標記物表達水平。
綜上所述，這些數據表明，患者對CAR-T細胞治療的反應包括兩個階段：（1）以CD8+ T細胞和CD4-CD8-HelioshiCAR-T細胞為代表的初始反應階段，以及（2）以細胞毒性增殖CD4+CAR-T細胞為主的長期緩解階段。
這些已經工作了十年的Ki67hiCD4+CAR-T細胞如何實現超長待機時間并如此有效？
接下來，研究人員在單細胞水平上分析了這組特定CAR-T細胞的克隆組成、蛋白質表達和轉錄組。
研究人員使用CD3+CAR+DAPI-細胞構建了單細胞TCR-seq和CITE-seq文庫，并通過嚴格的篩選條件獲得了1437個T細胞的單細胞特征。其中1149個是CAR-T細胞，288個是不表達CAR的普通T細胞。
普通T細胞非常多樣化，288個細胞檢測到170種不同的克隆類型；CAR-T顯示出強大的克隆優勢，1149個細胞僅包括27個克隆類型，其中前三個克隆占90%的CAR-T細胞。
在轉錄水平上，CAR-T細胞表現出明顯的增殖特征，表達PCNA、MCM6、TOP2A、CDK1、CCDNB2和MKI67。
研究人員還發現，大約30%的CAR-T細胞處于S期、G2期或M期，而非CAR-T細胞不到7%
此外，與非CAR-T細胞相比，9.3年的CAR-T細胞也顯示出其獨特的特性。CITE-seq顯示活化標記物CD38和HLA-DR在CAR-T細胞中高度上調，而抑制性受體如PD-1、TIM-3、LAG-3和TIGIT也上調。它們可能不僅與衰竭有關，還與T細胞激活狀態有關。
通過比較G1期的CAR+和CAR-CD4+細胞，研究人員確定了645個差異表達基因，其中上調的基因是CD4+效應T細胞的特征。
值得注意的是，在CD4+CAR-T細胞中檢測到細胞毒性相關酶蛋白的上調，例如編碼顆粒酶的GZMK和GZMA。編碼穿孔素的PRF1也上調。
為了直接測量這些長效CD4+CAR-T細胞的功能活性，研究人員通過與表達CD19抗原的K562細胞與1號患者的T細胞共培養，特異性地刺激CAR-T細胞。在CAR的抗原刺激下，脫顆粒標記物CD107a上調，同時表達的基因有MIP-1b、穿孔素和顆粒酶A，表明這些CD4+的CAR-T細胞具有直接的細胞毒性功能。
上述結果表明，這些CAR-T細胞在功能上表現出激活特性，而不是衰竭。與此一致，編碼細胞因子IL-10和IL-32的基因在CAR-T細胞中的表達也上調。GAPDH在所有細胞周期階段的CAR-T細胞中均上調，而LDHA和氧化磷酸化途徑僅在活躍細胞周期的細胞中上調，表明有氧糖酵解和線粒體依賴的氧化磷酸化可為CAR-T細胞增殖提供能量支持。
圖6. CAR-T細胞維持長期腫瘤抑制效應的機制模型。
在第二位患者中是否也存在表達GZMA和GZMK的長效CD4+CAR-T細胞？
通過檢查6.5年時2號患者的樣本，CITE-seq分析發現153個高質量的CAR-T細胞，其CD4+CAR-T細胞群與9.3年時1號患者非常相似。
總的來說，這兩名患者都有針對CD19的超長CAR-T細胞，在10多年后仍然可以檢測到，并且都保持了療效。
這些研究豐富了對CAR-T細胞治療白血病的長期療效的理解，這些發現將為未來的長效CAR-T研究帶來新的思路。
正如Carl June博士所說：“我們現在可以得出結論，CAR-T細胞可以治愈白血病”。
來源：生物前哨
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